Page 120 - วารสารการแพทย์แผนไทยฯ ปีที่ 18 ฉบับที่ 3

552 วารสารการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ ทางเลือก ปีที่ 18 ฉบับที่ 3 กันยายน-ธันวาคม 2563

ขั้นตอนก�รสกัด 2 เคลือบผิววุ้นด้วย 1 mM D-biotin ปริมาณ 100
วิธีการเตรียมสารสกัดผลปอบิด วิธีสกัดด้วยนำา ้ ไมโครลิตร เพลทที่ 3 เคลือบผิววุ้นด้วย 0.1 M L-his-

นำาผลปอบิด บดหยาบ จำานวน 800 กรัม ลงใน tidine ปริมาณ 100 ไมโครลิตร เพลทที่ 4 เคลือบผิว
้
round bottom flask เติมนำา 2,000 มิลลิลิตร เขย่า วุ้นด้วย 0.1 M L-histidine ปริมาณ 100 ไมโครลิตร
ให้สมุนไพรกระจายตัว ตั้งบนเตาให้ความร้อนแบบ และเคลือบ 1 mM D-biotin ปริมาณ 100 ไมโครลิตร

หลุม (heating mantle) จนเดือดเป็นเวลา 1 ชั่วโมง นำา single colony ที่เลี้ยงไว้ 1 คืนไปขีดลงบนวุ้น นำา
ทิ้งไว้จนเย็น จากนั้นนำามากรองด้วยถุงกรอง แยก เพลทบ่มที่ตู้บ่มอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา
ส่วนกากออก ระเหยสารที่กรองได้ด้วยเครื่อง rotary 24 ชั่วโมง แบคทีเรียที่มีการเจริญมากที่สุดคือ เพลท

evaporator จนได้สารสกัดเข้มข้นเตรียมสารสกัด ที่ 4 ซึ่งสามารถนำาไปใช้ในการทดลองเพื่อทดสอบฤทธิ์
เป็นผงแห้งด้วยเครื่อง freeze dry จะได้ %yield = ก่อกลายพันธุ์ได้
14.32% w/w ความต้องการกรดอะมิโนทริปโตเฟนสำาหรับ

วิธีการเตรียมสารสกัดผลปอบิด วิธีสกัดด้วยเอทานอล เชื้อ E. coli WP2
นำาผลปอบิด บดหยาบ จำานวน 1,600 กรัม ใส่ เตรียม Minimal Glucose Agar plate ที่ผสม

ลงในถุงกระดาษสำาหรับสกัดด้วยเครื่อง soxhlet 0.05 mM tryptophan นำา single colony ที่เลี้ยงไว้
extraction เติม 95% ethanol จำานวน 6,000 1 คืนไปขีดลงบนวุ้น นำาเพลทบ่มที่ตู้บ่มที่อุณหภูมิ 37
มิลลิลิตร เปิดเครื่อง soxhlet extraction วันละ 8 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ผลการทดสอบ

ชั่วโมง ตั้งสกัดไว้ 1 สัปดาห์ นำาสารสกัดที่ได้ มากรอง แบคทีเรียต้องมีการเจริญบนผิววุ้น ซึ่งสามารถนำาไป
ด้วยกระดาษกรอง ระเหยสารที่กรองได้ด้วยเครื่อง ใช้ในการทดลองเพื่อทดสอบฤทธิ์ก่อกลายพันธุ์ได้

rotary evaporator จนได้สารสกัดเข้มข้น แล้วเตรียม การตรวจ rfa mutation และ R-factor
สารสกัดเป็นผงแห้งด้วยเครื่อง freeze dry ได้ %yield เตรียม Minimal Glucose Agar plate
= 1.94% w/w ผสม 0.1 M L-histidine ปริมาตร 100 ไมโครลิตร

การควบคุมคุณภาพเคมี โดยวิธีหาปริมาณเถ้า สำาหรับเชื้อ S. typhimurium ส่วนเชื้อ E. coli ใช้
ปริมาณเถ้าที่ไม่ละลายในกรด และปริมาณความชื้น อาหารเลี้ยงเชื้อ MGA ผสม 0.05 mM tryptophan
ตามวิธีของตำารามาตรฐานยาสมุนไพรไทย ปี 2019 และbacterial culture ปริมาตร 300 ไมโครลิตร ลงใน

(Thai Herbal Pharmacopoeia 2019) [12] top agar ที่มีส่วนผสมของ 0.5 mM histidine + 0.5
mM biotin ปริมาณ 2,000 ไมโครลิตร ส่วน E.coli
ขั้นตอนก�รทดสอบคุณสมบัติเชื้อ 0.5 mM trypophan ผสมเข้าไป จากนั้นเทส่วนผสม

ความต้องการกรดอะมิโนฮิสทิดีนสำาหรับเชื้อ ลงบน MGA plate จุ่ม blank paper disc ที่ผ่าน
S. typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537 การฆ่าเชื้อลงใน 0.1% crystal violet แล้วจุ่ม blank

เตรียม Minimal Glucose Agar plate (MGA) paper disc ใน 8 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ampicillin วาง
เคลือบผิววุ้นด้วย 0.1 M L-histidine และ 1 mM ไว้อีกด้านหนึ่งของเพลท นำาเพลทบ่มที่ตู้ Incubator
D-biotin ดังนี้ เพลทที่ 1 ไม่เคลือบผิววุ้น เพลทที่ ที่ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ดูผลการ